一.脱蜡至水

1.     二甲苯Ⅰ(8min)

2.     二甲苯Ⅱ(8min)

3.     无水乙醇和二甲苯1:1(5min)

4.     无水乙醇(3min)

5.     95%乙醇(3min)

6.     85%乙醇(3min)

7.     75%乙醇(3min)

8.     PBS洗3遍

二．抗原修复

EDTA抗原修复液修复 。

抗原修复100℃  20min ; 自然冷却至室温 。

三．PBST洗2遍 ，PBS洗1遍 。每次5min 。

四．用30%H2O2和甲醇配制3%的H2O2溶液 。每张切片加1滴 ，室温下孵育10分钟 ，以阻断内源性过氧化物酶的活性 。PBS洗3遍 。

五．封闭  3-5%BSA或者1-2%FBS封闭30min

六．除去封闭液 ，每张切片加1滴或50μl的第一抗体 ，室温下孵育60分钟或4℃过夜 ，建议参见每种抗体的说明书 。

   抗体稀释液 ： 1%FBS溶液（可以加0.01%叠氮钠）

七．洗一抗 。PBS洗3遍 ，每次5min 。

八．孵二抗2h(室温)FITC标记 山羊抗小鼠二抗1:500 ，CY3标记的山羊抗兔二抗1 ：500 。

九．洗二抗   PBS洗3遍 ，每次5min

十．擦干标本边缘水分 ，加DAPI（1ug/ml）5min

十一. 把片子放PBS里 ，取一张擦干水分 ，加mouting（sigma M1289）,盖上盖玻片 ，指甲油封片 。