分子克隆与质粒载体构建

一、服务介绍

分子克隆是在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法 。常含有目的基因 ，用体外重组方法将它们插入克隆载体 ，形成重组克隆载体 ，通过转化与转导的方式 ，引入适合的寄主体内得到复制与扩增 ，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体 ，可以得到插入DNA的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增 。

 二 、实验原理

外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组 ，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子 。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下,有Mg2+ 、ATP存在的连接缓冲系统中 ，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接 。DNA连接酶有两种 ：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶 。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能 ，而且T4噬菌体DNA连接酶还有—种大肠杆菌连接酶没有的特性 ，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来 。但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低 ，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率 。

 T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分为3步 ： ，T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶—AMP复合物 ；然后 ，酶—AMP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上 ，使DNA腺苷化 ；后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来 。

 DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法 ，为了防止载体本身的自连 ，可以通过(牛小肠碱性磷酸酶)CIP处理克服 。

 连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性.但是在这个温度下 ，粘性末端的氢键结合是不稳定的 。因此人们找到了一个折中温度 ，即12-16℃ ，连接12-16h(过夜) ，这样既可大限度地发挥连接酶的活性 ，又兼顾到短暂配对结构的稳定 。

三 、实验流程

目的DNA的扩增和纯化 ；

连接反应 ；

电泳检测连接产物 。

四 、客户提供

样本DNA ，基因序列 ，试剂盒 。

五 、公司提供

构建好的载体 ，电泳胶图 ，测序结果 。

实验周期 ：大约1-2月 。